1、重组人胰岛素的研究历史 和生产工艺,BY: 王腾 时佳 孙玉新 玛依努尔,.,2,据世界卫生组织统计，2011年全球糖尿病患者2.8亿，在中国，已突破9200万人，发病率达10%，同时由于老龄化等因素，国内还有9000多万的潜在糖尿病患者。加之中国糖尿病患者整体治疗率不足三成，且人均胰岛素使用量偏低，仅为美国糖尿病患者人均使用量的0.8%，所以中国胰岛素市场潜力巨大。,重组人胰岛素,胰岛素定义： 胰岛素是由胰岛细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。 胰岛素结构： 胰岛素由A、B两个肽链组成。A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26

2、种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。,猪胰岛素 牛胰岛素 赖脯人胰岛素（礼来公司、速效Ins） 门冬胰岛素 （诺和诺德公司、速效Ins ） 甘精胰岛素 (安万特公司、长效Ins),人胰岛素原,B30 A8 ;A10 ;B30 B28 ;B29 B28 A21 ;B31 ;B32,3D Structure of Insulin,胰岛素二聚体（dimer）,胰岛素六聚体（hexamer ）,Ins的性质,胰岛素的功能 稳定性

3、 Ins在弱酸性水溶液中或混悬在中性缓冲液中较稳定 还原剂及多种重金属使Ins失活 紫外线、光氧化、超声波会引起Ins变性。 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。 药理作用 治疗糖尿病、消耗性疾病。,1921年-从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗的历史。 1926年-重结晶胰岛素 1930s-传统中、长效动物胰岛素 1970s-单峰胰岛素和 单组分胰岛素 70年代末-半合成胰岛素,重组胰岛素的研究历史,1982年-采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。 1998年，成功研制出了中国第一支基因重组人胰岛素制剂“甘舒霖” 90年代至今-重组

4、人胰岛 素类似物成功研发上市， 包括超短效和长效人胰 岛素类似物。,基因重组人胰岛素研 制成功,基因重组人胰岛素实验,.,11,中国胰岛素市场状况,放眼全球，胰岛素作为最重要的糖尿病治疗药物，在过去5年中取得了14%的复合增长率，2010年已达到145亿美元的销售额。但胰岛素市场高度集中于三巨头诺和诺德、礼来和赛诺菲安万特，三家公司占全球胰岛素90%以上的市场份额。,.,12,目前临床使用的胰岛素来源 1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。动物来源的胰岛素（28种） 2、半合成人胰岛素：将猪

5、胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。半合成来源的胰岛素（5种） 3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。基因重组来源的胰岛素（27种）,基因重组来源的胰岛素（27种）,.,15,胰岛素给药方式的发展,注射给药,非注射给药,.,16,一种新的注射给药方式:NIS泵,通过一条与人体相连的软管向体内持续输注胰岛素的装置。它模拟人体健康胰腺分泌胰岛素的生理模式。俗称“人工胰腺”。 维持血液中INS水平 缩短控制高血糖的时间 减少低血糖发生， 减轻病人多次皮

6、下注射INS的痛苦 INS泵是强化治疗的最佳手段,.,17,非注射给药,口服给药：由于采用了包裹的方法来保护胰岛素制剂，口胰岛素在胃及小肠内不被破坏，在大肠内分解、释放出来，通过肠黏膜进行吸收。,肺部给药：巨大的肺泡表面积、极薄的肺泡、丰富的毛细血管网、狭小的气血通路、低酶活性、肺深处较慢的清除速率等，这些良好的生理环境为蛋白多肽的吸收提供了有利条件。,眼部给药：INS主要通过眼结膜和鼻泪管黏膜吸收进入体循环两达到降糖效果。一般眼内容量少，INS作用时间短，生物利用度低因此人们致力于研究能延长INS作用时间的滴眼剂，并选择刺激性小的滴眼剂。,鼻腔给药黏膜内血管丰富黏膜上蛋白酶含量也比胃肠道中少

7、，减少了INS被酶破坏失活。提高了药物的生物利用度。许多药物动力学研究表明，鼻黏膜吸收INS的机制与体内内源性的INS释放极为相似，为鼻腔INS给药提供了理论依据。鼻腔给药需要加入吸收促进剂才能增加吸收效果,口服给药、局部给药,人胰岛素分类 传统中长效胰岛素 长效人胰岛素类似物 速效人胰岛素类似物 非注射胰岛素,速效胰岛素,特点： 起效快，皮下注射后15分钟起效。 达峰快，注射后15分钟起效，3060分钟达到药效高峰。 药效维持时间短，大约在3小时左右（24小时）。,药代动力学特点与进餐后人体内源性胰岛素分泌十分相似，能够很好地控制当餐后血糖而且不容易发生低血糖。,Lispro （赖脯胰岛素

8、，Humalog ）是第一个用于临床的速效胰岛素类似物,由美国礼来公司研制生产，将人胰岛素的B28与B29位的氨基酸对换。,Aspart（门冬胰岛素，Novolog ）由丹麦诺和诺德公司研制生产，结构与人胰岛素的区别在于用天冬氨酸取代了B链28位上的脯氨酸。,APIDRA （赖谷胰岛素，Apidra ）安万特公司研制，以赖氨酸和谷氨酸分别取代了人胰岛素B3位的天冬氨酸和B29位的赖氨酸。,长效胰岛素-人胰岛素类似物,1. 甘精胰岛素（ glargine ）： 商品名Lantus -甘氨酸替代胰岛素A链21位门冬氨酸、并在B链末端增加两个精氨酸。使胰岛素结合更多带正电的氨基酸残基，改变等电点，使

9、等电点由5.4上升至中性。这样，胰岛素类似物在酸性条件下可溶，在生理的近中性条件下结晶。 2. Insulin Detemir：商品名Levemir -胰岛素B链29位赖氨酸侧链通过酰基化连接一个N-16-烷基 酸的14碳游离脂肪酸 该游离脂肪酸能与白蛋白结合，延缓与胰岛素受体结合，从而延长其半衰期。,Insulin Detemir （Levemir ） 诺和诺德公司研制,glargine （Lantus） 安万特公司研制,胰岛素肺部吸入制剂-Exubera,辉瑞、万安特以及Nektar 共同研发 于2006.1.27被FDA批准 一种作用快的胰岛素干粉吸入剂 适用于餐前给药，其胰岛素吸收具有

10、速效化的特征,胰岛素制备工艺,重组DNA技术制造人胰岛素,AB链合成法：以人工合成的人胰岛素A链和B链基因分别与半乳糖苷酶基因连接，形成融和基因，分别在大肠杆菌中表达A链和B链，然后再通过化学氧化作用，通过二硫键连接起来。已被淘汰 反转录酶法：仿照天然合成途径 通过胰岛素原的cDNA合成，表达产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去C-肽得人胰岛素。,Ins A链,Ins B链,转化大肠杆菌,发酵,A链,B链,纯化,二硫键,活性胰岛素,AB链合成人胰岛素,反转录酶法合成人胰岛素,离子换，分子筛色谱，反相色谱结晶,CNBr裂解，去除保户多肽,发酵,胰岛素原融合蛋白,胰岛素原（ SSO3 ）粗品,亚硫基

11、化,胰岛素原,纯化,胰岛素原纯品,酶切解离A,B链,胰岛素粗品,纯化的人胰岛素,基因重组大肠杆菌生产重组人胰岛素工艺流程,破碎菌体 包涵体 尿素溶解 复性,酵母系统生产重组人胰岛素的工艺流程,发酵菌种 摇瓶种子培养 种子罐培养 生产罐发酵 微小胰岛素原溶液 离心除去菌体 超滤、离子交换吸附沉淀 纯化的胰岛素原 胰岛素粗品 胰酶和羧肽酶处理 离子交换色谱、分子筛色谱、二步反相色谱 重结晶、胰岛素纯品,.,30,酵母系统生产重组胰岛素,优点： 二硫键的结构与位置正确，不需要复性加工处理 缺点： 表达低，发酵时间长 表达载体结构基因组成：信号肽、前肽序列、MCS 和微小胰岛素原。 前肽序列引导目的蛋

12、白通过正确的分泌途径至胞外。 宿主：贝克酵母。 分泌量大，形成二硫键，培养基简单，高密度发酵，无热原和有毒物质,发酵生产重组人胰岛素设备,.,32,重组胰岛素的质量控制,测定生物活性 效价测定 控制产品中杂质或潜在有害物质 保证产品安全性和有效性,长期重复大剂量使用,.,33,通化东宝 1998年12月研制出中国第一支基因重组胰岛素“甘舒霖” 甘舒霖 R- 常规重组人胰岛素注射液 甘舒霖 N- 低精蛋白重组人胰岛素注射液 甘舒霖 30R- 30/70混合重组人胰岛素注射液 （ 30%常规重组人胰岛素和70%低精蛋白重组人胰岛素） 深圳科兴 苏泌啉- 常规重组人胰岛素注射液 苏泌啉恩- 低精蛋白重组人胰岛素注射液 徐州万邦 万邦林- 常规重组人胰岛素注射液 万苏林猪胰岛素制剂,胰岛素国内主要生产厂家,其他（持有药品注册证） -南京新天生物化学制药有限公司、华西医科大学制药厂、上海第一生化 制药厂、武汉生化制药厂 等,谢谢观看,