鸡蛋清中溶菌酶提取工艺研究 [摘 要] 从蛋清中用D152型弱酸阳离子交换树脂提取溶菌酶,将Na+型树脂用于吸附过程中,然后用NaCl溶液洗脱,设计二因素三水平的正交试验.蛋清提取率为-------,最适合的工艺为:10%NaCl洗脱,洗脱速度0.4mL/min.本方法减少了杂蛋白,提高了蛋清的再利用价值,降低了成本. [关键词] 鸡蛋清 溶菌酶 提取 层析柱法 1、序言: 溶菌酶(lysozyme.Lz)又称胞壁质酶(Nicolle)或N一乙酸胞壁质聚糖水解酶(N-Acetyl-muramide glycan hrdrlase),溶菌酶是一种碱性球蛋白,广泛存在于家禽和鸟类的蛋清中.哺乳动物的唾液,眼泪,尿,血浆及某些植物如萝卜,卷心菜中都含有溶菌酶.蛋白中溶菌酶含量最丰富鸡,占蛋清总蛋白的3.4%~3.5%,溶菌酶在食品中也有广泛的应用。可以将溶菌酶加在鲜牛奶或奶粉中,以增强食用牛奶和奶粉的婴儿的免疫力。也可以加入到西点、饮品、肉制品中,作为防腐剂以延长产品保质期,近年来,全世界农副产品、水产品、果蔬等食品腐烂变质而引起的经济损失十分巨大。如何防止食品的腐败变质越来越引起人们的重视,有关食品防腐剂的研究也日趋完善,食品防腐剂一般分为合成防腐剂和天然防腐剂,过去,人们大都使用合成防腐剂,但经长期的研究发现一些合成防腐剂有诱癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题,如苯甲酸盐可能会引起食物中毒现象,亚硝酸盐和硝酸盐可能会生成致癌的亚硝胺。
而天然防腐剂具有抗菌性强、安全无毒、水溶性好、热稳定性好、作用范围广等合成防腐剂无法比拟的优点。因此,近年来,天然防腐剂的研究和开发利用成了食品工业的一个热点。 1.1溶菌酶 1.1.1溶菌酶研究历史和现状 人们对溶菌酶的研究始于本世纪初,英国细菌学家弗莱明(Fleming)在发现青霉素的前6年(1922年)发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。随着研究的不断深入,发现溶菌酶不仅有溶解细菌细胞壁的种类,还有作用于真菌细胞壁的种类,同时对其作用机制也有了更进一步的了解。 1.1.2溶菌酶的性质 溶菌酶是一种化学性质十分稳定的蛋白,,在于燥条件下可在室温下长期保存,其纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末,无嗅,味甜,易溶于水,不溶于丙酮、乙醚。在ph1.2~11.3范围内,几乎不发生结构变化;对热极为稳定,在ph4~7,100oC处理1min基本保持酶原有活性。在酸性条件下是稳定的,此时100oC的加热处理使溶菌酶仅有很小的活性损失。 1.1.3溶菌酶的抑菌特性 溶菌酶对微生物的作用是其最主要的功能。
蛋清中的溶菌酶主要对G+菌最敏感,最敏感的是小球菌.枯草杆菌`巨大芽孢杆菌等。有些革兰氏阴性菌对酶有抵抗性。 溶菌酶对一些酵母菌也有抑制作用。许多酵母在低pH条件下产生气体.乙醇.和其他食品中不希望产生的物质导致食品的腐败,某些酵母对人类而言是致命的,溶菌酶对其有较好的抑制作用。 1.2溶菌酶的提取方法 溶菌酶是一种无毒无害的蛋白质,经研究表明和临床证实,溶菌酶具有杀菌、消炎、抗感染、消肿、增强免疫机能等作用,在食品中是一种天然安全性很高的食品保鲜剂,广泛应用于食品中。因此它是一种非常有希望的天然食品防腐剂,下面简单介绍一下溶菌酶在食品中应用的优势和缺点: 1)溶菌酶有非常高的热稳定性.鸡蛋清溶菌酶,是已知对热加工最稳定的酶之一,在pH4~5时,可在100摄氏度下保持活性1~2分钟,但随着pH的升高,其变性温度降低,而在缓冲体系中则表现很强的耐热性.但是在一些食品,特别是蛋白含量高的食品中,其热稳定性会下降,因为在加热时,溶菌酶会通过和其他蛋白形成二硫键产生共聚物而失去活性(Natoshi等,1991). 2)溶菌酶不会因为有机溶剂处理而失活,当转移回水溶液时,溶菌酶可恢复全部活性. 3)溶菌酶被冷冻或干燥处理时,活力稳定. 4)溶菌酶生产成本较低,鸡蛋清中溶菌酶约占总蛋清蛋白的3.5%. 5)溶菌酶适宜pH5.3~6.4,可用于酸性食品的防腐. 6)溶菌酶具有广泛的抗菌图谱,但主要局限于G+菌,对绝大多数G-没有抑制能力. 7)溶菌酶作为防腐剂安全性高,且在1992年FAO/WTO食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。
1.3溶菌酶在食品中的应用 1.3.1溶菌酶在乳制品中的应用 人们对溶菌酶添加于干酪等乳制品中的影响进行了广泛的研究,研究表明了溶菌酶加入乳中类似于凝乳酶,引起酪蛋白的降解。在鲜奶或奶粉中添加溶菌酶可起到许多药理和保健作用。 1.3.2溶菌酶在肉制品中的应用,溶菌酶可以对肉制品起防腐作用。 1.3.3溶菌酶在其他食品中的应用 在糕点中应用溶菌酶,可防止微生物的繁殖。在清酒中应用溶菌酶,以防止酸菌的繁殖。 2、材料与方法 2.1材料与方法 溶菌酶标准品(纯度99.99%);D152酸性阳离子交换树脂;干酪素;NaCl;NaOH;双缩脲试剂;以上化学药品均为分析纯蒸馏水校制; 2.2仪器 HD-21CA型核酸蛋白检测仪;HL-12恒流泵;BSZX系列自动部分收集器;色谱信号采集单元;TH-300梯度混合器;754型紫外可见光分光光度计;电脑一台 3、试验方法 3.1标准品的加样洗脱 Na型树脂75mL高27.7cm,液面高0.9,流速0.45mL/min,配制标准品溶液0.1g/100mL,取1mL,加样洗脱,洗脱液浓度分别为5%.10%.15%NaCl,洗脱三次。 3.2树脂吸附法提取溶菌酶的工艺研究 3.2.1树脂吸附法提取溶菌酶的工艺流程设计 本实验采用树脂吸附法提取溶菌酶,以鸡蛋为原料,通过搅拌吸附,上柱洗脱的方式分离鸡蛋白中的溶菌酶,现确定工艺路线如下: 新鲜鸡蛋→前处理→打蛋取蛋清→过滤→搅拌吸附→静置过夜→装柱上洗脱液→收集吸附液 3.2.2树脂的预处理 取一定量的D152型弱酸树脂,用清水,以流速不大于10m/h进行正洗和反洗,以达到去除杂质的目的。
6%NaOH处理:以树脂体积两倍的6%氨水,浸泡24h.体积膨胀2倍左右。用清水细至PH8-12,体积不变,加热后仍不变。 5%HCl处理:以树脂体积4倍的5%HCl溶液,浸泡24h.体积缩小为原体积。然后用清水洗至PH4-5.浸泡24h. 3.2.2搅拌树脂的制备 将10枚用水洗净,破壳取出蛋清,用两层纱布过滤三次,搅拌均质,将滤得的蛋清和已经预处理的树脂以2;1的比例混合,搅拌3小时,过滤,在5-7°C的温度下静置12h,装柱25cm液面高1cm,静置30min,将0.5%NaCl洗脱液装入梯度混合器中,对杂蛋白进行洗脱.等待色谱曲线升高再降至基线,用烧杯收集,马上换浓度高的洗脱液,换另一个锥形瓶收集. 3.2.3蛋白质浓度标准曲线的制作 取12个试管分成两组,分别加入0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0毫升的标准酪蛋白溶液,用水补足到2毫升,然后各加入4毫升双缩脲试剂,充分摇匀后,在室温下(20―25℃)放置30分钟,于540nm处进行比色测定。取两组测定的平均值,以酪蛋白的含量为横坐标,OD值为纵坐标绘制标准曲线,做为定量的依据。 3.2.3.1酶蛋白含量的测定 取2支试管分别加入溶菌酶的样品溶液1ml,用水补足到2毫升然后各加入4毫升双缩脲试剂,方法同上,得的样品的OD值,查标准曲线即得到蛋白质的浓度。 4、结果与讨论 4.1结果 4.1.1蛋白质浓度标准曲线
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