脂肪酶研究进展Pseudomonasaeruginosa脂肪酶X2衍射三维结构图假丝酵母脂肪酶B一、脂肪酶的概述1、脂肪酶(triacylglycerollipaseEC3.1.1.3)广泛的存在于动植物和微生物,脂肪酶是分解油脂的酶类，其水解产物一般为天然油脂，水解部位是底物甘油三酯中1（或3）位和2位的酯键，反应底物为甘油二脂、甘油单脂、甘油和脂肪酸。脂肪酶是类脂化合物分解、合成和酯交换的催化剂，广泛应用于食品、轻纺，皮革、香料、化妆品、有机合成，洗涤剂，医药等领域。活性中心是丝氨酸残基,正常情况下受1螺旋盖保护。嗜热芽孢杆菌脂肪酶3、脂肪酶的特性（1）位置专一性是指酶对底物甘油三酯Sn-酯键的识别和水解。（2）立体专一性一般是指酶对底物甘油三酯中立体对应结构的1位酯键识别和选择性水解。如猪胰脂肪酶水解甘油三酯时没有1二、脂肪酶的性质脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同。(1)最适作用温度不同来源的脂肪酶最适作用温度也不同。

大多数脂肪酶最适作用温度在30-60之间，但也有些脂肪酶在较高或较低温度下存有较高活力，Rathi等从假单胞菌中分离的一种脂肪酶，在100条件下仍然能稳定存活，甚至在150以上还有数秒钟半衰期。Bradoo等从B.stearothermophilu:中分离得到耐热脂肪酶，在100条件下半衰期为15-25min。一般真菌脂肪酶最适作用温度都相对较低，而细菌脂肪酶则较耐热。不同的作用底物，脂肪酶最适作用温度也有所不同。Surinenaite等研究表明，在假单胞3121-1培养中分离到一种脂肪酶，当以p-NPB(p-nitrophenylbutyrate)为底物时，脂肪酶的最适作用温度为52，以Tween-80为底物时，最适温度为50-60，以橄榄油为底物时，最适温度为50-65(2)最适pH及pH稳定性脂肪酶最适pH受多种因素影响，如来源、底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度等。来源不同脂肪酶，在一定条件下都有其特定最适pH和pH稳定范围。大多数细菌脂肪酶的最适pH值在中性或碱性范围内，稳定范围一般在pH值为4.0-11.0。真菌脂肪酶pH值稳定范围较宽，如红曲酶保持基本活力的pH值范围在pH4.0-6.0，少根根霉脂肪酶的酶活在pH值为6.0-8.0的范围内都较稳定毛根霉脂肪酶的pH值稳定范围为7.0-10.0。

(3)脂肪酶抑制剂同一种金属离子对不同的脂肪酶影响作用不同，对某一种起激活作用，而可能抑制另一种脂肪酶活性。脂肪酶的作用不需要辅助因子，但是二价金属阳离子，例如Ca2+能够提高大多数脂肪酶活性，其原因可能是形成了长链脂肪酸钙盐,同样也有例外，如从Paeruginosa10145中分离脂肪酶，在Ca2+存在条件下，其活性反而受到抑制。一般来说，Co2+＞Ni2+＞Hg2+和Sn2+对大多数多数脂肪酶活性都起到抑制作用，Zn2+和Mg2+在一定程度上也能抑制脂肪酶活性。金属离子对脂肪酶活性影响可逆抑制剂表面活性剂SDS(十二烷基磺酸钠、胆汁酸盐、蛋白抑制剂等对脂肪酶活性的是可逆抑制。这些物质不直接作用于酶的活性位，而是通过改变脂肪酶构象和界面表面特征发挥作用的。硼酸能够结合脂肪酶活性中心丝氨酸，形成半衰期较长的过渡态复合物，从而抑制脂肪酶活性。不可逆抑制剂脂肪酶属于丝氨酸水解酶，苯硼酸、对硝基苯磷酸二乙酷、苯甲基磺酞氟等能够共价结合与脂肪酶活性中心丝氨酸，从而不可逆抑制脂肪酶活性。反应介质对脂肪酶影响脂肪酶催化反应还受到反应介质的影响。水相体系有利于脂肪酶对醋的分解，非水相体系有利于醋的合成。

非水相并非绝对无水。酶活性的保持依靠维持其活性构象，而酶活性构象的形成依赖于各种氢键、疏水键等相互作用。水参与氢键形成，而疏水相互作用也只在有水参与时才能发生，因此水分子与酶分子活性构象形成有关。有机溶剂极性对脂肪酶催化活性也有影响影响，而极性的大小通过溶剂极性参数logP(P表示该有机溶剂在正辛烷和水双向体系中分配系数)来描述。研究者证明，溶剂logP值越高，脂肪酶催化能力越强。但当溶剂logp值很大时，溶剂对水的溶解度很低，微量水就可以使溶剂饱和，反应生成的水量大于溶剂溶解能力，水就会游离出来，聚集在酶周围，酶催化剂的传质性能就会下降，反应速率随之降低。三、脂肪酶的来源脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富。

由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用PH，用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。细菌脂肪酶细菌脂肪酶大多数是胞外酶易于液体深层发酵,生产比较容易。细菌脂肪酶大多数是碱性脂肪酶,且在pH4~11、温度30~60间具有良好的稳定性。假单胞菌属的细菌脂肪酶应用最为广泛。真菌脂肪酶真菌脂肪酶具有温度和pH稳定性、底物特异性以及在有机溶剂中具有高活性，且提取成本比较低等优点，因而发展迅速。商业化的真菌脂肪酶主要有:黑曲霉(Aspergillus-niger)米曲霉(ThermomycesLanuginosus)等。四、产脂肪酶微生物的筛选产脂肪酶的微生物种类很多，大约65个属微生物可产脂肪酶，其中细菌28个属，放线菌4个属，酵母菌10个属，其他真菌23个属，而实际上可能更多，脂肪酶产生菌中得到深入研究的主要集中在根霉、曲霉、毛霉、青霉，假单胞菌等具有工业应用价值的菌种以及与医学相关的金黄色葡萄球菌、钩端螺旋体、粉刺状杆菌等。

筛选方法：(1)嗅甲酚紫脂肪酶将油脂分解，产生的脂肪酸使溶液pH值下降引起色变。该法受指示剂变色范围的限制。(2)RhodamineB微生物产生的脂肪酶与Rhodamine的阳离子发生作用，在350nm紫外光照射下出现橙黄色的荧光物质，故产生脂肪酶的菌株周围会出现荧光圈，且荧光圈越大，表明脂肪酶的活力越高。（3）三丁酸甘油酯琼脂平板透明法脂肪酶分解平板中的三丁酸甘油酉旨产生透明圈，且透明圈越大表明脂肪酶活力越高。以三丁酸甘油醋或吐温80为底物的透明圈法和在橄榄油琼脂平板加入罗丹明B的荧光圈法常用于脂肪酶生产菌的筛选。可养微生物脂肪酶高产菌筛选 通常采用含甘油三酯琼脂平板法, 并通过在 培养基中添加指示剂如罗丹明B、溴甲酚紫、维 多亚蓝等作为筛选标记。 1981)采用脂 肪酶水解脂肪后产生的脂肪酸与维多利亚蓝反应 呈蓝绿色透明圈平板法筛选出产碱性脂肪酶的扩 展青霉。 不可养微生物脂肪酶产生菌的筛选 宏基因组(metagenome)技术绕过纯培养步骤，直接从生境样 品中获取遗传信息，提供更加全面的基因资源，从而有效地 提高了新酶的筛选效率。采用宏基因组技术筛选脂肪酶有两 种途径- 功能筛选和序列筛选。

功能筛选途径 即把来源于不可培养微生物的DNA 克隆到大肠杆菌质粒 中，构建宏基因组文库，然后基于脂肪酶活性筛选获得微生 物脂肪酶基因。 序列筛选途径以脂肪酶三联体活性中心(Ser-Asp-His)和氧阴离子 (oxyanion hole)区的保守序列设计引物，以环境基因组DNA 为模板，扩增脂肪酶基因片段，然后用基因组步查 (genomic-walking)的方法克隆出全长脂肪酶基因。 Bell 等用基于序列筛选途径从新西兰Kairua Park 温泉环境 基因组中克隆到一种新脂肪酶基因，并在异源宿主大肠杆菌 中实现表达。 五、脂肪酶的发酵生产及分离纯化 产脂肪酶发酵分两类: 固体发酵和液体发酵法。相对液体发酵法，固体发酵 生产脂肪酶具有简洁，经济的优点 影响菌株发酵产脂肪酶的因素有：氮源、碳源、底物诱导剂、表面活性剂、矿物质、pH, 培养温度、摇床转速、培养时间、接种量等。 （1）发酵培养基 有机氮源: 大豆粉、大豆饼粉、大豆蛋白、业麻饼粉、奶粉、酪蛋白、蛋白陈、酵母膏、 牛肉膏、玉米浸汁和无机氮硫酸钱、硫代硫酸钱、氯化氨、磷酸氢氨、磷酸二 碳源包括13种碳水化合物如葡萄糖、淀粉、麦芽糖、乳糖、甘露糖等和15种油 脂如荷荷芭油、玉米油、豆油、棕搁油、橄榄油、业麻油等 表面活性剂 包括吐温系列、Span系列、Triton x-405等 发酵培养基优化 由碳源、氮源诱导物及常见的无机盐等组成 速效碳源如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等有利于细菌脂肪酶的形成，而缓效碳源如 玉米粉和小麦粉等则有利于真菌脂肪酶的形成。

氮源 一般认为复合氮源对微生物生长及产酶效果较好。有机氮源一般比无机 氮源要好。 其他生长因子 1、钙离子和镁离子能促进脂肪酶的分泌 2、大多数微生物只有诱导物存在时才能产生脂肪酶。诱导物可以是甘油三酯、长链脂肪酸、脂肪酸酯及其表面活性剂。许多研究表明培养基 中添加表面活性剂如Tween 80、Triton X-100、SDS、PEG 和阿拉伯 胶等可以不同程度地提高脂肪酶的产量。 培养方式与发酵调控：脂肪酶的发酵生产可采用固体培养和液体深层培养两种方法。固体培养设备比较 简单，易十推广，但容易污染杂菌;液体深层培养易于控制，不易染杂菌，生产效率高， 目前生产上常采用液体深层培养法生产脂肪酶。液体深层培养通常采用分批(batch)、 补料分批(fed-batch)或连续(continuance)发酵方式生产脂肪酶。在分批发酵过程中， 所有营养物一次加入发酵罐中，发酵罐必须重复定期清洗、火菌、接种、发酵和收取 酶液，但是分批发酵法便十控制培养条件，酶的产量高，并且有利十阻止杂菌的污染， 是目前最为常用的一种方法。其缺点是周期长、生产效率低。在连续发酵工艺中，培 养液既有流入也有流出，发酵罐中培养液的体积和营养物的浓度保持恒定。

采用连续 发酵工艺能够获得更高的产酶效率，减少设备投资，降低产酶成本，但是不足之处是 所产酶的浓度较低。目前脂肪酶最常用的生产方法是补料分批发酵法。此法是分批发 酵中间歇地或连续地补加新鲜培养基的培养方法，是介十分批发酵和连续发酵之间的 过渡类型。此法一方面可以避免某种营养物质成分初始浓度过高出现底物抑制现象， 另一方面能防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽，影响细胞的生长和产物的 形成。补料分批发酵法兼有分批发酵和连续发酵的优点，克服了两者的缺点，是目前