华东理工大学生物工程学院酶是生物催化剂（Biologicalcatalyst），自然界一切生命活动都是在它参与下进行的，从这个意义上讲，没有酶就没有生命。从研究酶的历史可知，酶的研究一直从两方面进行：一是理论研究，从分子水平研究酶的结构与功能；二是应用研究，研究酶的催化反应、生产和应用。酶工程与药用酶就是酶领域研究中两颗最灿烂的明珠，现分述于后：一．用分子生物学方法酶的催化特性及设计新酶[1-6]酶结构与功能关系研究是关键以基因手段及蛋白质点突变修饰改进酶的特性及设计新酶种是一个革命性导向，而成败的基础在于对自然酶精确的静态及动态结构与催化功能的深入认识，也依赖于对基因模板分子结构与蛋白质合成机制的大量了解，但人类对这关键问题并未深化。在实验研究设计中往往带来很大的盲目性，片面性和偶然性。因而必须首先对功能基因组进行充分了解，必须阐明酶催化的分子机理，酶分子结构与构象变化的关系，结构与立体专一性，稳定性与变性态，体内多酶系统的定位及高效率催化等。基因工程酶对重要实用性的酶进行基因突变，重组、克隆与高效表达，构建优良的工程菌，以及酶的分子设计与点突变化学修饰，以改造酶的结构组分、活性、稳定性、特异性及催化功能等，开辟酶的新用途是目前生物技术发展的主流方向。

开发工业用基因工程酶，如美国TheProcterGamble公司用重组DNA技术发展高稳定性的，高活力的脂肪酶应用于去污工业。丹麦Novo公司克隆a-淀粉酶基因重组工程菌LA297的产酶速度提高20倍，活力达1.3万Novo位/毫升。此外，还构建了耐热的β-淀粉酶，脂肪酶工程菌用于工业生产。针对我国酶工业及医药工业的重大应用问题，我国已开展了有a-淀粉酶适合于乙醇发酵的基因工程菌，a-淀粉酶基因克隆到枯草杆菌中得到表达。此外，用DNA重组技术，使葡萄糖异构酶在E.Coli中表达，热稳定性提高50％以上，在细胞中酶蛋白含量为40%，此外，我国还开展了多聚糖酶、青霉素酰化酶、尿激酶原（单链尿激酶）、葡激酶、链激酶、铜锌超氧化物歧化酶、蛋白酶、凝乳酶、聚酮合成酶、丙酰化酶、色氨酸合成酶、硫霉素生物合成酶、溶菌酶等。酶的蛋白质工程构建用定点突变，化学修饰技术改进工业、医药、环境用酶的催化特性与功能是不容忽视的研究领域，已吸引人们的极大关注。例如：脂肪嗜热芽胞杆菌中性蛋白酶，其结构类似于Thermolysin(TLN)，两大结构域，以α-螺旋连接，将连接处Gly144改为Leu，这突变酶提高了活力，洗涤效果好，安全致敏性较Carisberg酶低三倍。

对丝氨酸蛋白酶的定位突变或活性部位导向性化学修饰，亦改善了酶的稳定性及氨解／水解的比值，使酶催化适合于药物多肽的合成，六个点突变的Subtilisin8350，其稳定性提高了300倍，活力提高了五倍，而Subtilisin8379我国亦进行了以医用为主的蛋白质或酶的蛋白质工程，如胰岛素、尿激酶原、天花粉蛋白、胰蛋白酶及其抑制剂、枯草杆菌蛋白酶、凝乳酶、葡萄糖异构酶及金属硫蛋白等，对这些天然酶的改造，已奠定了很好的技术基础。定点突变技术只对某些氨基酸残基进行替换，删除添加或修饰，但并不能从根本上动摇酶的高级结构，这种位点突变对酶功能的改建存在一定局限性，而在认识基因组功能，进行基因位点突变并通过多代遗传，将会构建出非天然的全新设计功能酶和蛋白质。二．构建新酶——抗体酶、核酶、模拟酶、印迹酶核酶广义地说核酶包括核酶和脱氧核酶两类，其生化本质分别是小分子的RNA和DNA。核酶最早由美国Colorado大学的CechAltman发现一种小分子RNA具有自身催化剪接功能，又称催化RNA或RNA催化剂，为此，他们于1989获得诺贝尔化学奖。核酶的发现开辟了生化研究的一个崭新领域，突破了酶是蛋白质这一传统概念。

此后，科学家们陆续发现了多种天然和人工合成的核酶，这些酶具有水解酶、激酶、氨基乙酸转移酶等各种酶活性。当前已有多种核酶类药物进入临床或临床前期试验（表1），其主要机理是作为分子剪刀使相关病毒RNA或DNA受到破坏，从而发挥抗病毒及抗肿瘤作用。脱氧核酶还可以用于抑制有害基因的表达。该类药物的优点是几乎不引起机体的免疫反应。药用核酶应用情况公司核酶作用对象研究阶段AlzaAnti-ribozymes临床前期AmericanCyanamidB细胞白血病-淋巴瘤临床前期ColumbiaUniversity人免疫缺陷病毒I一．二期临床GeneShears人免疫缺陷病毒I一．二期临床乙肝病毒、丙肝病毒临床前期Innovir乙肝病毒、丙肝病毒临床前期OsakaUniversity丙肝病毒临床前期RibozymePhamaceuticalsInc.人免疫缺陷病毒I血管生成因子一．二期临床临床前期TokyoUniversity丙肝病毒临床前期UniversityPittsburgh神经胶质瘤临床前期CityHope人免疫缺陷病毒I一．二期临床抗体酶是一类具有催化活性的免疫球蛋白，其可变区被赋予了酶的属性，故也被称为催化抗体。

它催化的反应多达十余种，如氧化还原反应、酰基转移反应、金属螯合反应、闭环反应、有机酯、碳酸酯水解反应、立体选择性的内酯反应、酰胺键的生成反应等等。抗体酶的制备方法很多，有诱导法、引入法、拷贝法、化学修饰法、分子印迹法、基因工程法等。其机理均源于酶反应的过渡态理论，实际上，抗体酶活性中心就是一种天然酶的过渡态类似物。抗体酶的催化效能可接近天然酶，单链抗体酶还具有分子量小、稳定性好、免疫原性低、容易透过组织膜、易从血液中清除以及不在肾中积累等优点；它的另一个重要特点是可以利用抗体能与抗原结合的特异性制备杂合抗体，因此也是研究抗体导向的靶向药物的一种重要手段。抗体导向的抗体酶药物前体治疗（Antibody-DirectedAbzymeProdrugTherapy,ADAPT）通过在肿瘤细胞附近靶向激活药物前体，使之转化为细胞毒性物质直接作用于肿瘤细胞的治疗。模拟酶模拟酶又称人工合成酶（synzymes），是利用有机化学方法设计和合成的一些较天然酶更简单的非蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。模拟主要从三方面进行：整体模拟、活性中心的模拟、类似简单模拟。模拟酶在结构上必须具有两个特殊部位——底物结合位点和催化位按照模拟酶的属性可将其分为主-客体酶、胶束酶、肽酶和分子印迹酶等。

其中主-客体酶中几种比较成功的模型有环糊精酶模型、冠醚酶模型、杂环化合物与卟啉类模型等。在模拟酶方面，固氮酶的模拟最令人瞩目，如过渡金属（Fe、Co、Ni的氮络合物，过氧化氢酶的金属（Fe、Cu、Co）络合物。虽然现在模拟酶的催化活性仅有少量能达到天然酶的活性，但是，随着蛋白质结构学和化学技术的发展，一定会有更好的模拟酶替代天然酶应用于工业生产，那时人们就可以用化学的方法构造出各种性能高效的模拟酶，为生产和生活服务。印迹酶从分子水平上模拟酶的功能是当今最富挑战的课题之一，Wulff 研究小组在 1972 年首次报道成功地制备出分子印迹聚合物。印迹分子（print molecule, 也叫做模板分子（Template,T），当它与带有官能团的单体分子接触时，会形成 多重的作用点，待聚合后，这作用就会被固定下来，模板分子除去后，聚合物中 就形成了与模板分子在空间上互补的多重作用位点的结合部位，这就是分子印迹 实验技术。利用分子印迹技术产生对底物的特异性结合部位，将催化官能团以确 定的排列引入结合部位，从而制备出具有催化活性的聚合物，就是分子印迹酶。 当以天然的生物材料，如蛋白质和糖类物质为骨架，在其上进行分子印迹而产生 对印迹分子具有特异性识别空腔时则称为生物印迹。

Kibanov等利用枯草杆菌蛋 白酶的抑制剂（N-Ac Tyr NH2）在水溶液中与这个酶作用，印迹后干燥，再 用有机溶剂去掉抑制剂后放入无水有机溶剂中，结果发现，用抑制印迹过的酶活 性比无抑制剂存在时冷冻干燥酶高100 三．酶工程中的若干应用热点[9-10] 酶工程是生物技术的一个重要组成部分。酶工程是指在一定的生物反应器 内，利用酶的催化作用，进行物质转化的技术。其应用范围已遍及工业、医药、 化学分析、环境保护、能源开发和生命科学理论研究等各个方面。近年来，美国、 欧洲共同体国家和日本，在酶工程研究和应用方面，发展非常迅速，继续在酶工 程领域居于领先地位。 在迈向 21 世纪知识经济时代之际，我们一定要紧紧跟踪国际酶工程领域的 最新动向，本着“有所为，有所不为”的原则，明确我们的研究方向，制定我们 的研究计划。为此，笔者根据个人的一些认识和体会，简要介绍国际上酶工程若 干“热点课题”，供选题作参考。 1.5.1 有机相酶反应 在传统概念中酶是催化水溶性底物的反应，在有机溶剂中不仅不能反应，还 会引起酶蛋白的变性。但实验证明，这种想法是片面的，许多酶在无水或含微水 （1%）的有机溶剂中，酶不仅能催化特殊反应，而且稳定性会显著提高。

由于 酶的反应介质的改变，使酶具备了不少水相中所不具备的特点。如：有利于疏水 性底物的反应；能明显提高酶的热稳定性；能催化在水中不能进行的反应；能改 变反应的平衡点；具有可控制的底物专一性；可防止由水引起的副反应；易于实 现固定化；产物易回收；便于清除产物和底物的抑制作用；可避免微生物污染等 等。目前已证实在有机相中酶可催化 C-O 键的形成、C-N 键的反应、C-N 有机介质中有代表性的酶催化反应催化剂 溶剂 催化反应 脂肪酶（粗提物） 非极性溶剂 酯合成、酯交换、肽合成、大 环内酯合成 蛋白酶（嗜热菌蛋白酶，枯 草杆菌蛋白酶，胰凝乳蛋白 乙酸乙酯戊醇 肽合成 固定化酶（羧基酯酶） 甲基丙酸酯 对映体选择性酯化外消旋醇 固定化醇脱氢酶 异丙醇 酮类底物的不对称还原 固定化多酚氧化酶 氯仿 酚氧化为喹咛 固定化扁桃酸腈酶 乙酸乙酯 光学活性R-腈醇的合成 由于有机相酶催化反应的诸多特点，受到研究人员的广泛关注。目前已有不 少比较成熟的工业应用，如脂肪酶/酯酶用于生产精细化工产品（图 1），有机相 中用酶法拆分生产手性药物等。 脂肪酶拆分生产拟除虫菊酯的工艺1.5.2 组合生物催化 组合生物催化（Combinatorial Biocaralysis）是酶催化、化学催化和微生物转 化在组合化学中的应用，即通过对先导化合物的生物转化产生库（图 2）。

组合 生物催化技术的应用大大加快了产生新化合物的速度，经过良好设计的组合化学 库还可以大大提高化合物结构的多样性。 生物催化的重要课题——酶法拆分手性化合物因分子内含有一个或多个不对称碳原子而具有不同的性质。有时 同一药物的两个对映体的药效和毒性甚至可相差几十到几百倍。鉴此，美国FDA 申明：外消旋药物不得作为单一化合物对待，新药上市要尽可能以单一手性异构 体形式出售，消旋药物申请时需要同时提供两个对映体的全部数据。这一政策极 大地促进了手性药物的发展。 目前化学合成的市售药物有 1327 种，具有手性的药物 528 种，以单一手性 药物出售的仅为61 种，预计到2005 年手性药物销售额将从1990 年占销售总额 9％增加到40％，市场份额将超过1000 亿美元。其经济效益巨大。 生物催化最重要的特点是专一性（包括立体专一性）强，因此酶工程将在手 性药物合成和手性拆分方面大有用武之地。