海因酶的研究进展生物工程进展~20o1。Voi21,H0。3海因酶的研究进展杨柳孙万儒中国科学院微生物研究所。徽生物资潦国家重点宴验室北京100080)摘要海目酶在生产手性药物中间体上具有广泛的应用价值,本文综述了海目酶的研究历史,分类与进化,酶学性质,工业应用及发展方向。关键词海目酶手性药物前言海困酶是一类催化水解海因,5。取代海因及其海因衍生物的内酰胺键水解的酶。在工业上具有广泛的应用价值,主要用于生产D型氨基酸。海因酶归类于环酰胺酶(EC3。5。2),依据其作用的底物不同分为四类:二氢嘧啶酶(EC3。52。2);尿囊酶(EC3。5。2。5);羧甲基海因酶(EC3。5。2。4);N。甲基海因酶(EC3。5。2。14)。另外还有一些未被命名的海因酶,包括代谢途径已知的酰胺酶,羧乙基海因酶及些代谢机理尚不十分清楚的海因酶。根据其作用的底物的特异性或产物的光学活性不同,还可以将海因酶分为L海困酶的历史第一篇有关海因酶的报道始于3o年代初。50年代初,Grisolia等人开始研究嘧啶的代谢途径,相继发现了N。乙酰。B。丙氨酸脱羧酶,3,5,6-二氢嘧啶酶。1954年在研究乳清酸微生物代谢中发现了另种不同的海因酶,称之为5。

羧甲基海因酶。1957年Wallach等人首次提出了海因酶与二氢嘧啶酶是致的观点。在Brown和Kies1959年的研究基础之上,1963年l-lassal和Greenbeg致力于L。组氨酸,L。5。丙基海因的酶法降解'。。70年代开始人们的兴趣集中于5。苯海因及其3。甲基(乙基)衍生物的代谢途径。1970年Dudley第一次发表了利用哺乳动物海因酶水解D。苯海因生成N。氨甲酰基。D。苯基。氨基酸,同时他们还发现了未水解的I及酶催化的消旋。这些重大发现使人们越来越意识到利用海因酶生产具有光学活性的氨基酸的重要国家自然科学基金(批准号29790128)支持课题*通讯联系^性。与此同时,国际市场对非天然的氨基酸,如D苯甘氨酸,D。对羟苯甘氨酸,D。甲硫乙基苯甘氨酸的需求量大增,因为它们可以作为一些半合成抗生素的侧链。70年代到90年代,着重研究了不同微生物,动物,植物来源的D广型海因酶,并对其进行了纯化,性质的研究,发酵条件的优化,以便适应工业化生产的需求。1983年Hoechst发表嗜热芽孢杆菌(Bacillusthemophilic)SPLUI220D-海因酶的基因序列并且在大肠杆菌(Esche6chiaeoli)HB121得高效表达。

在以后的探索中,相继从微生物中发现N-氨甲酰基。氨基酸水解酶,它可以与海因酶联合作用使底物直接生成相应的氨基酸;继而又发现了海因消旋酶,此酶主要促进海因及其衍生物的消旋。海园酶的分类2。1海因酶(Hydantoinase)1957年wallach和Grisoka通过实验证明80%纯化的海因酶不仅可以水解海因,也可以水解二氢尿嘧啶,二氢胸腺嘧啶,因此很久以来一直把海因酶和二氢嘧啶酶混为一谈,认为海因酶是二氢嘧啶酶的别名。(反应机理见图1)1993年Run~r和Mey-el"分离的Agrobacter~ums,o。只作用于海因和5。取代海因,而不能水解二氢嘧啶。1995年Ogawa等人报道了Blastobactersp。可以水解海因和二氢嘧啶,但它的代谢途径与二氢嘧啶酶截然不同综上所述,二氢嘧啶酶与海因酶是不同的,海因酶专指一类水解海因或5。取代海因衍生物的酶,其中D型海因酶与二氢嘧啶酶一致,换言之,二氢嘧啶酶是海因酶的一种,称为D。海因酶。广义地讲,海因酶是一群催化具有不同的代谢途径的酶。13H2OR;H:二氯尿嘧啶R=CH:二氯胸腺嘧啶R--Crl】:3-脬基丁酸\,_一coow海因酶(EC3。

5。2。2】的催化反应机理2。11D一海因酶(二氢嘧啶酶)从50年代开始相继研究了细菌,酵母菌,动物,植物中嘧啶及其类似物的还原代谢途径,二氢嘧啶酶在此代谢中起到非常重要的作用(见图2)二氢嘧啶酶在人体代谢中也具有重要的作用,首先代谢些嘧啶类似物,如5。氟尿嘧啶,环恶烷,前者可以用于肿瘤的治疗,后者常用作于心脏保护剂;其次此酶在恶性肿瘤中的含量高于正常组织。海因酶具有高度的立体选择性和广泛的底物特异性。表一列举了微生物D。海因酶的纯化及性J一海因酶(二氢嘧啶酶)大多是同型二聚体或四聚体,亚基的分子量在50KD到60KD之间,需要金属离子作为辅因子,酶的活性易被一些螯台剂,如嘧啶的还原降解途径2。1。2L海因酶BacillusbrevisATCC8185是第一株用于水解混旋海因生成L型氨基酸的菌株。此酶需要ATP,Mg2,K作为辅因子并选择性作用于L型底物,酶反应的最适pH为8。0,最适温度为50,酶作用的底物范围很窄。一些实验室提取到了另一类L14因酶,又称L-5芳香基一海因酶,它具有广泛的底物特异性,主要作用于带有芳香取代基的海因衍生物,它们只能被D,L-5吲哚甲基海因或其N。3甲基衍生物所诱导产生,而其它的海因,环酰胺则不能诱导产微生物来源的海因酶的纯化及性质^H^'酬凸eudomo~ukmlfl朋【"fDM6各各种取代海因纯化步骤硫酸鱼精蛋白及硫琉水色谱(I~tetly-硫酸鱼精蛋白及硫离子交换色谱(DE。

硫酸鱼精蛋白厦硫酸绩沉淀,离子变换lBe一)。酸饿沉淀,。离子交AE—Toyopear)酸饿提蓰。,热处色谱(DE。4E。Cellu一博fS-400)换色谱(DEAE-C,dlu一理,离子交换色谱0)厦制备电棘懈e)羟基磷灰石色(DEAE—seplld谱。凝腔色谱{sDlla—HIC(Octyt一卵pb0)最适温度50口c55口c45-55口c55口c60热稳定性(50口c4060(70最适pH82—9。29。080—9080100pH稳定性655。5—8560—7075—10。5金属离子辅基无FeF+。c+,M分子量23000oDaI90000Da250000DB亚基及持子量4X邡00oDB46200ODB*原文j戟如此2。13立体选择性作为分类依据的可行性众所周知,人们通常以立体选择性作为海因酶分类的依据,将其分为L型和无选择型,但是这种分类方法并不是绝对的,比如据报道Flavobac。tenuresp。海因酶对于底物吲哚甲基海因而言是L选择性[u(L+D):0。98,转化率达49%,而对于底物苄氧基甲基海因而言则是D型选择性D,(D+L)=0。90,转化率达21%:。1993年Volkel报道了种依赖于底物决定立体选择性的Arthrobactersp海因酶。

May等人1998年发现了一株菌Arthrob0r。DSM3745,它所产的海因酶作用于吲哚甲基海因具有较高的L型选择性(E100),而对于甲硫乙基海因而言此酶选择性很差(E=3)。二氢嘧啶酶水解5一取代海因表现为D型海因酶,然而AgrobacterhtmpIPI--671 海因酶虽然是D 型海因 酶,但它的生理机能与二氢嘧啶酶截然不同"】由 此可见,立体选择'眭相同的海因酶具有不同的生理 机能,进一步讲,利用立体选择性并不能完全反映出 不同海因酶之间的进化关系。 22 羧甲基海因酶(Carboxymethylhydant0inaseEC3 5。2。4) 1960 年Akamatsu 在Bacillusbret,is 中发现了一 种不同于二氢嘧啶酶和羧乙基海因酶的诱导酶,它 可以将相应的海因水解为L。天冬氨酸,进一步的研 究发现羧乙基海因可以诱导羧乙基海因酶和二氢乳 清酸酶,却不能诱导羧甲基海因酶。尽管羧甲基 海因酶可以用来生产天冬氨酸,但该酶的底物 谱,酶学性质及该酶与其它海因酶的关系尚有待于 进一步的探索。 2。3 尿囊素酶(AllantoinaseEC3。5。2。5) 尿囊素酶又称5 一酰脲海因酶。

在植物和微生 物的嘌呤代谢途径中,尿囊索酶的作用十分重要,它 和尿囊素水解酶,脲囊素酰胺水解酶联台作用使脲 囊素水解生成脲素和乙醛酸。该酶可以被大部分带 有脲环的化合物所诱导,但可以供其作用的底物很 少。关于尿囊索酶用于水解5 一取代海因的报道很 有限 海因酶的底物依赖性,辅因子和亚基组成3。1 有关立体选择性的底物依赖性 海因酶和二氢尿嘧啶酶对不同底物的选择?眭不 同。例如,来自于Arthrobacter 和Norcardlaceae 因酶具有相似的底物谱:海因不能作为底物,但在5位碳原子上用甲基连接疏水基团后的海因可以很好 的作为底物。而对于L 选择性的吲哚甲基海因或苯 基海因,是因为两种对映体具有空间结构差别较大 的侧链,与酶的活性中心疏水作用差别较大,所以具 有选择性。二氢尿嘧啶酶催化底物的结构有所不 同,它选择'眭水解D。型5。单取代的海因,此酶不需 要甲基连接基团甚至疏水作用,因为未被取代的海 因也可以有效的被水解。对于海因酶和二氢尿嘧啶 酶对不同底物的选择性不同的结果的解释还都只是 15 推测,还需要对于这些选择性模型假设加以证实。 3。2 辅因子和亚基组成 海因酶是金属依赖型的酶。

添加不同的金属离 子可以使海因酶激活,也可以使金属螯合剂导致失 活的酶再激活。来自于A6tt/,l'e$ce/k~DSM3745 尔zn"。zn可能与酶的结构,催化基团,调节基 团有关。1998 年May 等人证明Arthrobacter 海因酶 结合的zn"对酶的催化和结构有一定的作用。通 过对化学修饰酶的进一步研究证明组氨酸与zn' 的结合有关。通常水解酶中的zn 的催化作用是 通过激活水分子来实现的,而水分子的激活需要降 低它的解离度从而提高它的亲核性。一般水分子的 解离度为l5。7,结合了zn 四聚体后解离度降至7。 海因酶的分子进化蛋白质的序列对于揭示它的生物功能具有重要 的意义。对氨基酸亲水性图谱的研究,二级结构预 测,超二级结构的分析,氨基酸序列分析结果可以作 为研究序列和功能关系的一条线索。目前一些海因 酶的代谢功能尚未清楚,人们试图通过对海因酶生 物特性,免疫功能的研究来探索它们之间的进化关 系。例如,通过对Ad"—WDSM3745 海因酶的 序列分析和基因结构的研究,发现该酶是一个特殊 的蛋白质家族中的一员,这一家族包括二氢嘧啶酶, 反应调节蛋白(脑衰蛋白),尿囊酶,二氢乳清酸酶和 脲酶。

目前,有关羧甲基海因酶,羧乙基海因酶,酰 胺酶的序列信息很有限,因此它们与其它海因酶进 化关系也有待于研究。N 一甲基海因酶的生化特性有 别于其它海因酶,来自于Pseudomonassp。NS671 酶是ATP依赖型,不具有立体选择性,有人认为它 是一种新型的海因酶;另一种ATP 依赖型海因酶来 源于B。brevis,它不接受N 一甲基海因作为底物,也