人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。在此，pcr技术应运而生。

PCR(Polymerase Chain Reaction)，即“聚合酶链式反应”，是为了解决在体外特异性地扩增某个基因的问题，从而满足对核酸的体外研究和应用。

pcr技术发展：

时间

大事记

1953

DNA结构基础

沃森和克里克发表的DNA双螺旋结构模型标志着分子生物学的诞生，这一成果也被誉为20世纪以来生物学方面最伟大的发现[1]。自此，人类一直在探索研究DNA的新方法，新技术。

1971

PCR技术雏形

Khorana第一个成功完成基因的合成—丙氨酸tRNA编码基因[2]；Kleppe提出体外扩增设想[3]。但由于当时的技术水平有限，并且具有较强稳定性的DNA聚合酶还未被发现，DNA体外扩增技术并未获得全面推广。

1985

PCR技术首次提出

Mullis阐述了具有划时代意义的PCR技术[4]。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中提供体外合成合适的条件---模版DNA，寡核苷酸引物，dNTP，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。最初使用的大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。

1988

PCR技术的优化

Saiki等在黄石公园温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus, Taq) 中提取到一种耐高温DNA聚合酶[5]。该酶耐高温的性质使其热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶,从而极大地提高了PCR扩增的效率。Taq酶的发现，使得PCR真正变为现实，为其自动化铺平了道路。

1989

PCR爆炸年

美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首，将热稳定DNA聚合酶命名为“年度分子”。

1996年

qpcr登上舞台

1996年，Real Time Quantitative PCR的发表标志着qPCR的诞生[4]。它引入了荧光标记的水解探针，并在每个PCR循环的延伸结束后采集荧光信号，将到达指数扩增期所需的循环数（Ct值，后经标准化统一为Cq值）与模板的初始浓度建立了关系

20世纪末

数字pcr出现

至20世纪末，Vogelstein 等提出数字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，将一个样本分充分稀释，分配到不同的反应单元，每个单元包含少于或等于一个拷贝的目标分子( DNA 模板) ，在每个反应单元中进行单独、平行的PCR反应分，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，以实现绝对定量及稀有等位基因的检测。

随着生物实验需求的不断发展，PCR技术在其发展的历程中，已经逐渐演化出一系列侧重于不同实验目的及应用的PCR分类，其中较为常见的包括：touchdown PCR、multiplex PCR、qPCR以ddPCR。

pcr试剂发展：

PCR试剂根据用途可分为：

1.提取试剂，包括了各种提取dna的常用试剂，和纯化所用的试剂

2.pcr扩增试剂：主要是taq酶，dntp（四种碱基），缓冲试剂（buffer），引物

3.产物检测试剂：琼脂糖，聚丙烯酰胺凝胶，aps，tmed，eb等等

而其中DNA聚合酶是pcr中比较重要的试剂：

在PCR技术中，DNA聚合酶起着至关重要的作用，从某种意义上说，DNA聚合酶的研究进展决定着PCR技术的发展趋势和应用范围，研究者们一直在努力探寻着酶学性能好、保真度高的PCR用DNA聚合酶。

时间

大事记

1985

PCR技术首次提出

Mullis阐述了具有划时代意义的PCR技术[4]。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中提供体外合成合适的条件---模版DNA，寡核苷酸引物，dNTP，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。最初使用的大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。

1985

Klenow酶

1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等科学家发明了具有划时代意义的聚合酶链

式反应，但其最早使用的DNA聚合酶是⑶// DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生

成的C末端605个氨基酸残基片段,即Klenow酶。该片段保留了 DNA聚合酶I的5'—3'聚合酶和3'—5'

外切酶活性，但缺少完整酶的5'—3'外切酶活性。Klenow酶不耐高温，在60尤下就会很快变性失活，引物链延伸反应需在37T下进行，因此每次循环都要重新添加Klemovv酶

1988年

Taq DNA聚合酶

Saiki等在黄石公园温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus, Taq) 中提取到一种耐高温DNA聚合酶[5]。该酶耐高温的性质使其热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶,从而极大地提高了PCR扩增的效率。Taq酶的发现，使得PCR真正变为现实，为其自动化铺平了道路。

Tth DNA 聚合酶

Tth DNA 聚合酶是是从嗜热性嗜热杆菌 HB8 中分离的一种分子量为 94 KD 的单亚基聚合酶，与 Taq酶相比在氨基酸序列上具有 88%的同源性，其基本特性与 Taq 酶相似，具有 5'→3' 聚合酶活性和 5'→3' 外切酶活性，不具 3'→5' 外切酶活性。最适温度在75℃，在 95℃时酶活性半衰期为 20 min。在高温条件下，当反应体系中存在 Mn2+，该酶具有很强的反转录酶活性，能有效地将 RNA 反转录成 c DNA。当鳌合了

Mn2+后再加入 Mg2+，则可以使该酶的聚合酶活性增

加，反转录产生的 c DNA 在此酶的作用下还可以进行

PCR 扩增，使得 c DNA 的合成与扩增用同一种酶。由于普通的逆转录酶如 M-MLV、ANV 等的最适反应温度为 37℃，在此温度条件下反应，RNA 分子形成的发夹、回环等高级结构很难克服，致使反转录合成过程效率大为下降，而 Tth DNA 聚合酶在较高的温度下进行逆转录，增加了引物杂交和延伸的特异性，减少了由于 RNA 二级结构引起的问题，所以现在被广泛用于反转录－聚合酶链式反应 （RT-PCR），对于从RNA 水平检测和分析基因表达十分有用。

Vent DNA 聚合酶酶

Vent DNA 聚合酶是美国 New England Biolabs

公司由海底火山口生长的嗜热高温球菌中分离纯化

获得的，相对分子量为 85 KD。该酶具有强的 5'→

3'DNA 聚合酶活性，兼有 3'→5' 外切酶活性，没有检

测到 5'→3' 外切酶活性。Vent DNA 聚合酶是被分离

得到的第一个具有 3′→5′核酸外切酶活性的热稳定

DNA 聚合酶。3'→5' 外切酶活性的主要功能是校对作

用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被 3'→

5' 外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核

苷酸，从而有效降低碱基错误掺入率，提高扩增结果

的忠实性。因此，Vent DNA 聚合酶是一种高保真的

耐热 DNA 聚合酶，其保真度比 Taq DNA 聚合酶高

5~15 倍。Vent DNA 聚合酶热稳定性极好，97.5℃下半衰期长达 130 min，且该酶扩增长片断（>12 Kb）的功能较强。

Pfu DNA 聚合酶

Pfu DNA 聚合酶来自激烈热球菌。该酶分子量约为 90 KD，具有 5'→3'DNA 聚合酶和 3'→5' 外切酶活

性，不具 5'→3' 外切酶活性，因此 Pfu 酶可即时的识

别并切除错配核苷酸，具有理想的扩增保真度。常见

热 稳 定 DNA 聚 合 酶 Vent、DeepVent、Tli、Pwo、Pfu、UlTma 等都具有校正功能，但 Pfu 酶比这些校正酶低2~60 倍的低错误率显示出极高的保真度。同时该酶也具有极高的热稳定性，95℃条件下半衰期大于 18 h，97.5℃下半衰期大于 3 h。Pfu 酶是目前使用最广泛的高保真热稳定 DNA 聚合酶，主要用于对 PCR 保真性要求较高的实验，如基因筛选、克隆表达、突变检测、定点突变等等。但此酶也存在一定的不足，如其延伸速率比 Taq 酶低近 6 倍，其原因是酶本身低的催化效率以及来自 3'→5' 外切酶活性的干扰。对于长距离模板的扩增尚不能很好的实现，一般长度在 2 Kb 内的DNA 片段扩增效果甚佳。

随着分子生物学研究的不断发展和深入，PCR 技

术的应用领域也不断拓宽，对热稳定聚合酶的性能要

求也越来越高。除了上述的几种 DNA 聚合酶外，现在很多生物公司利用基因重组和定点突变技术开发出

了具有不同特性的、适应不同研究要求的聚合酶类

型，如 Takala 公司推出的 LA Taq DNA 聚合酶和 EX

Taq DNA 聚合酶，不仅聚合能力大大提高，如前者可

以扩出约 30 kb 的超长片断，后者可以顺利扩出 5 kb

的片断，而且均具有 3'→5' 外切酶活性，保证扩出产

物的保真性。再如 Finnzymes 公司利用蛋白质融合技

术将一种双链 DNA 结合蛋白（Sso7d 蛋白）与具有校对功能的热稳定 DNA 聚合酶融合，形成了一种独特的高性能的聚合酶———Phusion 高保真 DNA 聚合酶。双链 DNA 结合蛋白的存在提高了聚合酶对双链

DNA 的亲和力，使得每次酶与双链发生结合反应时

都能够掺入更多的核苷酸，并减少了链延伸所需的结

合反应次数。Phusion DNA 聚合酶的处理能力大约是

Pfu DNA 聚合酶的 10 倍，是 TaqDNA 聚合酶的 2 倍。这种强大的处理能力不仅缩短了延伸时间，而且提高了酶的扩增性能，使其能够在更短的时间里扩增更长的模板。正是这些独特的优点，使 Phusion DNA 聚合酶同时适用于常规 PCR 和要求较高的 PCR。

DNA 扩增的忠实性、特异性和高效性是 PCR 成

败的关键。寻找新的 DNA 聚合酶或利用生物学技术

改造已有的 DNA 聚合酶，是实现或尽量提高上述 3

个目标的主要手段。如何进一步提高热稳定 DNA

聚合酶的酶学性能，成为广大分子生物学研究者关注

的热点。对于热稳定 DNA 聚合酶的研究将使 PCR 技

术更为完善，并更广泛地应用于生命科学的各项研究

领域中。

Taq DNA聚合酶发现了几十年，不但没有被取代，反而在分子生物学领域具有越来越广泛的应用。这一方面依赖于它自身的功能和特点，另一方面也依赖于研究人员对其不断的进化与改造。通过定点突变、结构域重组、定向进化等技术，Taq DNA聚合酶获得了许多催化性能改善或展现新功能的突变体，拓宽了酶的应用范围，下面就来做一个回顾。